이름:타도에이즈 2002/2/6(수)

ELISA검사법        동아제약 에이즈진단시약(ELISA) 내용 설명서 제3세대 HIV 진단시약 에이즈디아 원/투 3.5 Anti-HIV 1/2 Dignostic Kit. AIDSDIA 1/2 3.5 인혈청 및 혈장중의 인간면역결핍바이러스 1, 2형 항체를 검출하기 위한 제 3세대 효소면역측정시약 3rd Generation Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) Kit for the simultaneous Detection of Antibodies to Human Immunodeficiency Viruses Type 1 and/or Type(HIV-1, 2) Contained in Human Serum or Plasma 서   론 에이즈디아 원/투 3.5는 인혈청 및 혈장중의 인간면역결핍바이러스(HIV:Human Immunodegiciency Virus) 1형 및 2형에 대한 항체를 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay)으로 검출하는 진단시약입니다. 에이즈디아 원/투 3.5는 HIV-1형의 p24, gp41과 HIV-2형의 gp35 항원 유전자들을 유전자재조합 방법으로 대장균에서 발현한 후 순수 정제한 항원을 사용함으로써 민감도를 향상시켰으며, 비특이반응을 최소화시켰습니다. 특히 에이즈디아 원/투 3.5는 HIV-1, 2항원-과산화효소접합체(conjugate)를 사용한 sandwitch법 진단키트이며, HIV에 대한 1gG, 1gM 및 모든 종류의 항체를 측정하므로 조기진단이 가능한 제품입니다. 성분·함량 구성시약(96 Test/Kit 중) (1) 항원흡착플레이트(Antigen Coated Plate)....................................................1플레이트(96웰)    1웰(Well)중 유전자재조합 인간면역결핍바이러스 1, 2형 항원액......................................0.12ml (2) 농축접합체액(HIV antigen HRPO conjugate 50X).........................................................0.4ml    1병(0.4ml)중 유전자재조합 인간면역결핍바이러스 1, 2형 항원액/과산화 효소 접합체.......0.5v/v% (3) 양성대조액(Positive Control.. 3X).............................................................................0.8ml    1병(0.8ml)중 인간면역결핍바이러스 항체액...........................................................0.005v/v% (4) 음성대조액(Negative Control. 3X).............................................................................0.8ml    1병(0.8ml)중 액상건강인혈청..................................................................................50v/v% (5) 검체용희석액(Specimen Diluent)...............................................................................30ml    1병(30ml)중 소혈청...............................................................................................30v/v% (6) 접합체용희석액(Conjugate Diluent)............................................................................20ml    1병(20ml)중 소혈청...............................................................................................20v/v%    염소혈청..............................................................................................................10v/v% (7) TMB 농축기질액(TMB Substrate. 100X)....................................................................0.3ml    1병(0.3ml)중 테트리메칠벤지딘.................................................................................2.1mg (8) 기질용완충액(TMB Diluent)......................................................................................30ml    1병(30ml)중 과산화수소35%.................................................................................0.02v/v% (9) 반응정지액(Stopping Reagent).................................................................................30ml    1병(30ml)중 황산........................................................................................................2N (10) 농축세제액(washing Solution. 20X).........................................................................50ml    1병(50ml)중 폴리소르베이트 20................................................................................1v/v% 성  상 1. 항원흡착플레이트: 무색플레이트 2. 농축접합체액: 무색 내지 엷은 황색의 액상 3. 양성대조액: 황색의 액상 4. 음성대조액: 황색의 액상 5. 검체용희석액: 황색의 액상 6. 접합체용희석액: 황색의 액상 7. TMB 농축기질액: 무색 내지 엷은 황색의 액상 8. 기질용완충액: 무색의 투명 액상 9. 반응정지액: 무색의 투명 액상 10. 농축세척액: 무색의 투명 액상 효능·효과 혈청 및 혈장 중의 인간면역결핍바이러스 1, 2형의 항체 검사 용법·용량 A. 검체 준비 및 저장 1. 검체준비 (1) 검체는 혈장과 혈장을 모두 사용할 수 있습니다. (2) 검체는 용혈이나 미생물 오염이 안된 것을 사용하십시오. (3) 가열로서 불활화한 검체는 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 사용상 주의하십시오. (4) 헤파린 처리한 혈장은 피브린(fibrin)에 의해 검사에 영향을 줄 우려가 있으므로 트롬빈     (trombin)이나 황산 프로타민(protamine sulfate)으로 처리하여 완전히 응고시키고 형성된 응고물질은 간단한 원심분리방법 등으로 제거한 다음에 사용하십시오. (5) 검체는 반드시 실온에 도달한 후에 사용하십시오. 2. 검체의 저장 (1) 검체는 즉시 검사하지 않을 경우 2∼8℃에서 냉장 저장하거나 -15℃이하에서 냉동시켜 저장하십시오. (2) 검체 저장시에는 미생물 오염에 주의하고 7일 이내에 검사하십시오. B. 검사시약의 준비 1. 모든 시약은 검사 시작 약 30분 전에  실온에 방치하여 사용하십시오. 2. 세척액 (1) 농축세척액을 사용 전에 증류수로 필요한 양만큼 20배 희석하여 사용하십시오. (2) 냉장보존 상태에서 결정이 생길 수도 있습니다. 이런 경우에는 37℃로 따뜻하게 하여 잘 흔들어 녹인 다음 희석하여 사용하십시오. 3. 접합체액 (1) 농축접합체액을 사용하기 10분 전에 접합체용 희석액으로 50배 희석하여 사용하십시오. (8test당 접합체용 희석액 1ml에 농축접합체액 20㎕를 더하여 희석하십시오.) (2) 희석한 접합체액은 3시간 이내에 사용하십시오. 4. TMB 기질용액 (1) TMB 농축기질용액을 사용하기 전에 기질용 완충액으로 100배 희석하여 사용하십시오. (8test당 기질용 완충액 1ml에 TMB 농축기질액 10㎕를 더하여 희석하십시오.) (2) TMB 농축기질액은 냉장보관시 얼어있을 수 있으므로 완전히 용해시킨 후 사용하십시오. (3) 혼합된 TMB 기질용액은 거의 무색이며 푸른빛을 나타낼 경우 기질액의 변질을 의미하므로 다시 만들어야 합니다. (4) 희석한 TMB 기질용액은 4시간 이내에 사용하십시오. C. 조제한 시약의 저장방법 및 사용기간   조  제  시  약   :  저  장  방  법 : 사  용  기  간   접  합  체  액   :    15 ∼ 30℃   :      3시간   TMB 기질용액 :    15 ∼ 30℃   :      4시간   세    척     액   :    15 ∼ 30℃   :       1주 D. 개봉된 시약들의 저장방법 및 사용기간   시    약    명       :   저  장  방  법    :  사  용  기  간   항원흡착플레이트:       2 ∼ 8℃       :      4주   농축 접합 체액    :       2 ∼ 8℃       :      4주   양 성 대 조 액     :       2 ∼ 8℃       :      4주   음 성 대 조 액     :       2 ∼ 8℃       :      4주   검체용  희석액    :       2 ∼ 8℃       :      4주   접합체용희석액   :       2 ∼ 8℃       :      4주   TMB농축기질액  :       2 ∼ 8℃       :     12주   기질용  완충액    :       2 ∼ 8℃       :      4주   반 응 정 지 액     :  2∼8℃또는 실온 : Kit의 유효기간까지   농 축 세 척 액     :     2 ∼ 8℃         :      8주 E. 검사과정 (1) 검사에 필요한 만큼의 스트립을 꺼내 스트립홀더에 고정하여 사용하십시오. (남은 스트립은 실리카겔을 넣고 밀봉하여 2∼8℃에 보관하십시오.) (2) 검체용 희석액 100㎕씩을 플레이트의 각 웰에 넣으십시오. (3) 각 대조액(음성대조액 3개, 양성대조액 2개)과 검사하고자 하는 검체 50㎕씩을 플레이트의 웰에 차례로 분주하여 검체용 희석액과 잘 섞이도록 하십시오. (4) 플레이트를 37℃±1℃에서 1시간 동안 반응시키십시오. (5) (4)의 반응이 끝나기 10분 전에 농축접합체액을 접합체용 희석액으로 1:50의 비율로 필요한 만큼 희석하여 준비하십시오. (6) 반응이 끝나면 희석방법에 따라 희석한 세척액을 웰당 250㎕를 사용하여 플레이트의 웰을 5회 반복하여 세척하십시오.(세척액 분주 후 약 10초간 방치한 담 세척액을 제거하도록 하십시오.) (7) 세척한 플레이트의 웰에 희석방법에 따라 미리 희석한 접합체액을 100㎕씩 분주하십시오. (8) 플레이트를 37℃±1℃에서 30분 동안 반응을 시킵니다. (9) (8)의 반응이 끝나기 10분 전에 TMB 농축기질액을 기질용 완충액으로 필요한 만큼 1:100의 비율로 희석하여 준비하십시오. (10) 상기 (6)번과 같은 요령으로 플레이트의 웰을 세척하십시오. (11) 미리 조제한 TMB 기질용액을 플레이트의 웰에 100㎕씩 분주하십시오. (12) 15∼30℃의 암소에서 30분간 효소반응을 정지시킵니다. (13) 각 반응 웰에 반응정지액 100㎕씩을 넣어 효소반응을 정지시킵니다. (14) 엘리자판독기(ELISA READER)를 이용하여 음성대조액, 양성대조액, 미지검체의 흡광도를 측정하십시오. 이 때 흡광도 측정은 반응정지액을 첨가한 후 30분 이내에 수행하십시오. 정확한 측정을 위해서는 600∼650nm의 한 파장을 표준파장(Reference  Wavelength)으로 하여 450nm에서 흡광도를 측정하십시오. 적당한 기기가 없을 경우에는 450nm에서의 흡광도만을 측정하여 흡광도로 사용하여도 됩니다. F. 결과판정 1. 음성대조액 3개의 평균 흡광도 값을 구합니다. 음성재조액은 전체 검사 결과의 중요한 자료가 되므로 다음 기준에 적합해야 합니다.  (1) 각 음성대조액의 흡광도 값은 0.150보다 작거나 같고, 0.000보다 크거나 같아야만 검사가 유효합니다.  (2) 각 음성대조액의 흡광도값은 평균 흡광도 값의 0.5배 이상 1.5배 이하이어야 합니다. 만일 한 개의 값이 이 범위를 벗어나면 나머지 두 개의 값으로 평균값을 계산하고, 두 개의 값이 이 범위를 벗어나면 재검사를 실시해야 합니다. 한 개의 값이 이 범위를 벗어나는 경우는 기술상의 문제가 주요 원인이므로 보완해야 합니다. 2. 양성대조액 2개의 평균 흡광도 값을 구합니다. 3. 양성대조액과 음성대조액의 평균 흡광도 값의 차가 0.7이상이어야 검사 결과가 유효한 것 입니다. 만약 이 기준에 미달한 경우에는 기술상의 문제나 시약의 변질에서 비롯한 것이므로 그 원인을 확인하여 재검사를 실시해야 합니다. 4. 음성대조액의 평균 흡광도 값에 0.250을 더해 판정 기준치로 합니다.  판정기준치(cut off value)=NCx바+0.25 5. 판정기준치와 검체의 흡광도를 비교하여 결과를 판정합니다. 검체의 흡광도가 판정기준치보다 작으면 반응성이 없는 것으로 간주하고 음성으로 판정합니다. 검체의 흡광도가 판정기준치보다 크거나 작으면 반응성이 있는 것으로 간주하고 음성으로 판정합니다. 검체의  흡광도가 판정기준치보다 크거나 같으면 반응성이 있는 것으로 간주하고 이 검체를 다시  두 개의 웰에 넣어서 재검사를 해야 합니다. 재검사결과 하나 이상의 웰에서 반응성이 있으면 양성으로 판정하고 두 개의 웰 모두 반응성이 없으면 음성으로 판정하십시오. 사용상의 주의사항 1. 검사에 사용한 모든 검체, 시약 기구 등은 감염원이 될 수 있으므로 취급에 주의하십시오. 2. 감염 가능 물질의 취급시에는 비닐장갑을 사용하고, 취급 후에는 손을 깨끗이 씻으십시오. 3. 양성대조액, 음성대조액 및 검체가 엎질러졌을 경우 1% 차아염소산나트륨 용액으로 완전히 닦아  제거하십시오. 4. 모든 검체 및 검사시 사용된 비닐 장갑 등은 감염 성분이 포함되어 있는 것으로 간주하여 고압증기멸균기에서 적어도 121.5℃에서 1시간 이상 멸균한 후 처분하십시오. 5. 체외 진단용으로만 사용하십시오. 6. 서로 다른 Lot의 시약을 섞어서 사용하지 마십시오. 7. 시약병의 뚜껑을 열거나 내용물을 꺼낼 때 미생물이 오염되지 않도록 주의하십시오. 8. 피부나 점막조직에 TMB 기질용액이 닿지 않도록 하십시오. 9. 반응이나 보관시 TMB 기질액이 불필요하게 강한 빛에 노출되지 않도록 하십시오. 10. TMB 기질용액은 산화제와의 접촉을 피하십시오. 11. TMB 기질용액과 반응정지액은 금속과의 접촉을 피하십시오.